本发明公开了用于进行陆地植物物种鉴定的基于rbcL基因的特异引物对及其应用。本发明提供的特异引物对，由单链DNA甲和单链DNA乙组成；所述单链DNA甲为15-40bp且具有序列表的序列1所示的DNA片段的DNA片段；所述单链DNA乙为15-40bp且具有序列表的序列2所示的DNA片段的DNA片段。所述单链DNA甲可为序列表的序列1所示的DNA片段；所述单链DNA乙可为序列表的序列2所示的DNA片段。利用本发明提供的特异引物对，可开发通用试剂盒，有效鉴别陆地植物物种，推动植物DNA条形码发展和服务社会。
1.特异引物对，由单链DNA甲和单链DNA乙组成；所述单链DNA甲为序列表的序列1所示的DNA片段；所述单链DNA乙为序列表的序列2所示的DNA片段。
2.权利要求1所述特异引物对在辅助进行陆地植物物种鉴定中的应用。
3.权利要求1所述特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为辅助进行陆地植物物种鉴定。
4.包含权利要求1所述特异引物对的试剂盒；所述试剂盒的用途为辅助进行陆地植物物种鉴定。技术领域
本发明涉及用于进行陆地植物物种鉴定的基于rbcL基因的特异引物对及其应用。
背景技术
DNA条形码技术（DNAxa0barcoding）是指利用一段标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA序列片段作为标记来实现对物种的快速、准确和自动化鉴别技术。该技术的出现，使传统分类学方法得到了补充，能够解决传统分类学方法无法鉴定的物种，除此之外它还有助于发现新种和隐种，同时也可以应用于民族药（如蒙药）的开发、利用。首先将分子方法拓展到整个生物分类应用中并提出“DNA条形码”这一概念的是加拿大圭尔夫大学教授、加拿大皇家学会会员Paulxa0Hebert。Hebert等人最先把该技术运用在动物的研究中。经过大量对动物的研究，最终提出采用线粒体COI基因中1段约650bp的DNA片段为动物的DNA条形码。COI基因在植物中的进化速率远慢于在动物中的进化速率，因此COI基因只适合低等植物中的某些藻类并不适合作为大多数植物的DNA条形。所以到目前为止，在陆地植物中还没有通用的DNA条形码。近些年来，通过对植物核基因组、线粒体基因组、叶绿体基因组的大量研究得出几大结论。核基因组的复杂性使得单拷贝(或低拷贝)基因的筛选比较困难。线粒体基因组具有的很多特性使其在系统发育研究中的应用受到限制，如线粒体基因组大小在各植物类群中变异很大(大多数被子植物线粒体基因组大小在300～600kb)，因此在植物中，线粒体基因组一般情况下不是系统发育基因组学研究的理想资源。叶绿体基因组相对保守，但包含许多变异区域，同时还具有如下自身的优势：a、单亲遗传，避免了基因重组的发生；b、含大量的DNA成分，即使模板DNA高度降解也易扩增成功；c、叶绿体DNA无论在序列还是在结构上都相对保守,因而保证了类群间的可比性。所以认为从叶绿体组中选择植物DNA条形码是可行的。由于植物的特殊性，植物DNA条形码选择一直未定。最初生物条形码联盟(CBOL)建议的植物DNA条形码为matK、rpoC1、rpoB、accD、nhdJ和ycf5。但是由于accD、ndhJ和ycf5在一些类群中发生了丢失，在后来的验证中被排除了。除了上面提及的片段，还有一些研究提出了新的片段，Kressxa0etxa0al.(2005)提出了ITS,trnH-psbA，rbcL几个片段可以作为植物的DNA条形码片段。Hollingsworthxa0etxa0al.(2011)总结了植物DNA条形码的选择，先后共有15个片段被列为植物的DNA条形码。最终在2009年，在墨西哥城召开的第三届国际DNA条形码会议上，与会代表对植物DNA条形码达成初步共识，决定将叶绿体基因片段rbcL和matK作为植物DNA标准条形码的核心码，同时建议将叶绿体基因片trnH-psbA和核基因片段ITS作为植物DNA条形码的补充码。
发明内容
本发明的目的是提供用于进行陆地植物物种鉴定的基于rbcL基因的特异引物对及其应用。本发明提供的特异引物对，由单链DNA甲和单链DNA乙组成；所述单链DNA甲为15-40bp且具有序列表的序列1所示的DNA片段的DNA片段；所述单链DNA乙为15-40bp且具有序列表的序列2所示的DNA片段的DNA片段。所述单链DNA甲可为序列表的序列1所示的DNA片段；所述单链DNA乙可为序列表的序列2所示的DNA片段。本发明提供的特异引物对的的特点是，是基于陆地植物中的多个物种总结设计的，能扩增不同物种，且每个物种的扩增效果均好。所述特异引物对可用于辅助进行陆地植物物种鉴定。本发明还保护所述特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为辅助进行陆地植物物种鉴定。本发明还保护包含所述特异引物对的试剂盒；所述试剂盒的用途为辅助进行陆地植物物种鉴定。本发明还保护以待测植物的rbcL基因为模板，用所述特异引物对扩增得到的DNA片段。所述DNA片段在辅助进行陆地植物物种鉴定中的应用也属于本发明的保护范围。利用本发明提供的特异引物对，可开发通用试剂盒，有效鉴别陆地植物物种，推动植物DNA条形码发展和服务社会。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1、通用引物的设计rbcL基因位于叶绿体基因组（cpDNA）大单拷贝区(largexa0singlexa0copy，LSC)上，位于atpB和accD基因之间。rbcL基因在高等植物中，不含有内含子，长度为1428bp，共编码476个氨基酸。以往的研究工作表明，rbcL基因具有通用性好、易扩增、易对比的特点，不论是在分子系统发育研究中还是在DNA条形码的研究中都是一个非常重要的基因。rbcL基因作为植物的核心DNA条形码之一，能够解决、提高rbcL引物的通用性，设计能够在被子植物、裸子植物、蕨类植物、苔藓植物、绿藻类植物和轮藻类植物等各大植物类群中都通用的引物将会推动rbcL基因在系统发育研究和DNA条形码中的应用。rbcL基因是用于分子系统学最早的分子标记，在Genbank中，有将近4万多条序列，包含了陆地植物比较常见的各种植物的序列。但是越来越多的分析显示rbcL基因的分辨率有限，但是rbcL仍然被作为了DNA条形码的核心条码，那么怎样更好利用rbcL基因则成为首要的问题。在一个基因内部，其分辨率不一致已经得到一些研究的支持。分析rbcL基因后证实在不同的类群中，rbcL并不是之前所认为的5’端。而DNA条形码所要求的片段大小应该在600bp左右，利用rbcL基因分辨率最高的一段作为DNA条形码片段则可以最大限度的提高该基因的分辨率。在GenBank中下载所有陆地植物的叶绿体rbcL基因序列，然后用编写perl命令程序对数据进行分类，共分为轮藻、绿藻、苔藓、石松类、蕨类、裸子和被子植物7类。然后按照上述分类提取每个属中rbcL基因最长的序列作为基础数据库用于后面的分析。利用软件MAFFT比对序列，然后再Se-Alxa0Version2.0软件手动调整比对结果。利用perl命令计算比对片段长度大于500bp序列在同一碱基位置上的碱基组成，如果同一个位点95%以上的碱基均相同，那么该位点被认为是保守位点，当连续出现20碱基以上这样保守的位点，将生成一个保守序列片段（允许中间出现至多5个碱基低于95%）。根据rbcL基因高变位置的结果，决定把引物的位置放在200-300bp和1100-1200的位置。通过对序列的保守性分析，结果各大类群中在312bp-344bp、1150-1187bp的区段内都存在保守序列，因此在这两个位置分别设计通用引物（rbcL-Forwardxa0Primer和rbcL-Reversexa0Primer）。rbcL-Forwardxa0Primer（序列表的序列1）：5’-AGAxa0CCTxa0WTTxa0TGAxa0AGAxa0AGGxa0TTCxa0TGT-3’；rbcL-Reversexa0Primer（序列表的序列2）：5’-TCGxa0GTYxa0AGAxa0GCRxa0GGCxa0ATAxa0TGCxa0CA-3’。实施例2、通用引物的应用被子植物178个科，178个样品（每个科选一个样品）。裸子植物11个科，11个样品（每个科选一个样品）。蕨类植物33科，33个样品（每个科选一个样品）。苔藓类植物24个科，24个样品（每个科选一个样品）。共计178+11+33+24=246个样品（见表1）。1、提取待测植物的基因组DNA。2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用rbcL-Forwardxa0Primer和rbcL-Reversexa0Primer组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增体系（10ul）：10×PCRxa0Buffer（Mg²⁺）1ul、2mMxa0dNTP1ul，5uMxa0rbcL-Forwardxa0Primer0.5ul，5uMxa0rbcL-Reversexa0Primer0.5ul，5ng-50ng/ul基因组DNA1ul，5U/ulxa0Taqxa0DNAxa0polymerase0.1ul，ddH₂O5.9ul。PCR扩增的仪器为Veriti型梯度PCR仪。PCR扩增程序：94℃，4min预变性；94℃变性30s、50℃退火40s、72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。3、取2ul步骤2的PCR扩增产物，与4.5ul1×溴酚蓝混合，进行1%的琼脂糖凝胶电泳。结果见表1（+，扩增成功；-，扩增失败）。表1应用通用引物鉴定246个样品的电泳结果ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="617"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="471"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="466"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="464"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="464"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="468"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="462"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>经过验证，该引物在苔藓植物扩增成功率为87.50%；蕨类植物扩增成功率为90.91%；裸子植物扩增成功率为100%；被子植物扩增的成功率为98.88%。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="520"/>